در نگاه اول، qPCR یک تکنیک بسیار ساده به نظر می رسد، و زمانی که بهینه شود، می تواند به نتایج عالی منجر شود.
با این حال، برای به دست آوردن نتایج ثابت و دقیق که منعکس کننده آنچه واقعاً در نمونه شما می گذرد، کنترل های خوب برای داده های qPCR عالی بسیار مهم هستند.
یکی از این کنترل های کلیدی منحنی استاندارد qPCR است. این به شما امکان می دهد تا کارایی پرایمرهای خود را بررسی کنید.
پرایمرهای کارآمد برای داده های qPCR عالی مهم هستند
طراحی و آزمایش پرایمرهای qPCR با استفاده از منحنی استاندارد قبل از انجام هر آزمایش qPCR یک الزام مطلق است! اطمینان از اینکه مقادیر Ct به دست آمده با ارزش هستند و واقعیت را منعکس می کنند، مهم است.
پس از دریافت پرایمرهای جدید، اغلب برای اجرای qPCR خود برای به دست آوردن نتایج جدید بی تاب هستید. اما اگر ابتدا از آزمایش پرایمرها اجتناب کنید، ممکن است نتایج کاذب به دست آورید و زمان زیادی را از دست بدهید. ریسکی که هیچ محققی نمی خواهد بپذیرد.
چه پرایمرها را با نرم افزار بیوانفورماتیک طراحی کنید، چه برای کمک به Bitesize Bio بیایید یا دنباله ای را انتخاب کنید که قبلاً منتشر شده است، نمی توانید تضمین کنید که پرایمرهای خود خوب هستند. حتی اگر منحنی مذاب منجر به یک پیک منفرد خوب و تمیز شود، این نشان دهنده قابل استفاده بودن الیگوها نیست. آنها هنوز ممکن است هدف را به طور موثر در طول یک تکثیر DNA وابسته به دوز تقویت نکنند.
بنابراین، همیشه باید پرایمرهای خود را با منحنی استاندارد qPCR آزمایش کنید. منحنی استاندارد qPCR تضمین می کند که پرایمرهای شما به طور موثر و دقیق به هدف خود متصل شده و آن را تقویت می کند، که بسیار مهم است.
نحوه انجام منحنی استاندارد qPCR
برای انجام یک منحنی استاندارد qPCR، واکنش‌های qPCR را برای تقویت مقادیر مختلف از یک نمونه DNA تنظیم می‌کنید. از نظر تئوری، پرایمرهای کارآمد منجر به منحنی دوز-پاسخ متناسب می شود.
برای به دست آوردن یک منحنی استاندارد خوب، در حالت ایده آل به حداقل پنج نقطه داده در چندین مرتبه بزرگی (رقت های 5 تا 10 برابری) نیاز دارید.
سپس باید مقادیر Ct به‌دست‌آمده را روی محور y و تعداد کپی‌های log DNA در هر میلی‌لیتر را روی محور x رسم کنید. نمونه ای از منحنی استاندارد در شکل 1 در زیر نشان داده شده است.
شما همچنین می خواهید نمونه ها را در سه نسخه اجرا کنید، بنابراین می توانید تکرارپذیری را ارزیابی کنید.
برای به دست آوردن نتایج دقیق، رقت های متوالی انجام دهید و در هر واکنش همان حجم DNA را پیپت کنید. از آب به جای DNA به عنوان یک کنترل منفی برای شناسایی آلاینده ها در واکنش و تشخیص تقویت پس زمینه استفاده کنید.
همچنین، مطمئن شوید که نمونه DNA شما با کیفیت است (DNA سالم، غلظت مناسب و نسبت خوب 260/280).
تجزیه و تحلیل منحنی استاندارد شما
برخی از نرم افزارهای qPCR دارای برنامه هایی برای تجزیه و تحلیل منحنی استاندارد شما هستند. این منحنی را تولید می کند و کارآیی واکنش را محاسبه می کند. چند مقدار وجود دارد که می خواهید هنگام تجزیه و تحلیل منحنی خود محاسبه و ارزیابی کنید.
راندمان PCR
منظور ما وقتی در مورد کارآیی PCR صحبت می کنیم چیست؟در شرایط ایده آل در طول PCR ، تعداد مولکول های DNA باید هر چرخه را دو برابر کند. این کار 100 ٪ راندمان می دهد ، این همان چیزی است که ما در تلاش برای دستیابی به آن هستیم. واکنش ها به ندرت کامل هستند ، بنابراین ، دامنه های قابل قبول از راندمان بین 90 تا 110 ٪ است.
ممکن است فکر کنید ، چه کسی ، چگونه می توانید بیش از 100 ٪ کارایی داشته باشید؟این امکان پذیر است و معمولاً مهار پلیمراز را نشان می دهد. این مهار در کمترین نمونه های رقیق قوی ترین خواهد بود. از آنجا که نمونه ها رقیق می شوند ، غلظت مهار کننده ها کاهش یافته است (به دلیل رقیق شدن) و این می تواند منجر به کارآیی بیش از 100 ٪ شود.
اگر کارآیی بیش از 100 ٪ را مشاهده می کنید ، سعی کنید نمونه های خود را بیشتر رقیق کنید یا از جمله رقت های بالاتر در محاسبات بهره وری استفاده کنید.
برای مقادیر زیر 90 ٪ ، شما ممکن است آلودگی مهار کننده یا راندمان آغازگر ضعیف داشته باشید.
نحوه محاسبه راندمان PCR
نرم افزار qPCR زیاد راندمان PCR را برای شما محاسبه می کند ، اما اگر می خواهید خودتان آن را محاسبه کنید ، می توانید از معادله زیر استفاده کنید:
برای به دست آوردن درصد راندمان ، فقط تعداد 100 را ضرب کنید.
مقدار r 2
The R 2 value is the coefficient of correlation and should be >0. 99 برای ارائه اعتماد به نفس در همبستگی.
این مقدار به شما امکان می دهد که بین مقادیر هر نمونه رابطه خطی خوبی وجود داشته باشد یا خیر. مقدار کم می تواند نشان دهنده رقت سریال ضعیف باشد. برای جلوگیری از این امر ، هنگام انجام رقیق سریال خود ، از پیپت ، با استفاده از پیپت های خوب کالیبره شده اطمینان حاصل کنید و رقیق ها را به خوبی مخلوط کنید.
نحوه محاسبه مقدار R 2
برای محاسبه این مقدار به صورت دستی ، یک نمودار را با ورود به سیستم رقت هر نمونه در برابر مقدار متوسط CQ ترسیم کنید. اکسل مقدار R 2 را محاسبه می کند ، که می توانید با اطمینان از "معادله نمایش در نمودار" در گزینه های نمودار انتخاب کنید.
انحراف استاندارد برای مقادیر CQ
انجام تکرار به کاهش خطاها کمک می کند و باعث می شود مقادیر کارایی R 2 و PCR شما قابل اطمینان تر باشند. با این حال ، اگر تکرار شما بیش از حد متفاوت باشد ، شما مقادیر قابل اعتماد برای اینها دریافت نخواهید کرد.
برای بررسی اینکه تکرار شما چقدر قابل اعتماد است ، انحراف استاندارد (SD) را محاسبه کنید. تکرار خوب باید در 0. 2 واحد SD باشد. اگر اینگونه نباشند ، ممکن است شما نیاز به تغییر مجدد منحنی استاندارد خود داشته باشید.
اگر داده های خوبی از منحنی استاندارد qPCR خود به دست آورید، به خوبی در مسیری قرار دارید که از کارایی پرایمرها راضی باشید! اما اگر داده های منحنی استاندارد شما چندان خوب نباشد چه اتفاقی می افتد؟
اگر پرایمرهای شما کارآمد نباشند چه؟
به طور شگفت انگیزی اغلب اتفاق می افتد که منحنی استاندارد qPCR منجر به یک منحنی نامتناسب می شود. هر غلظت DNA تقریباً به همان مقدار Ct منجر می شود. این بدان معنی است که پرایمرها هدف را به طور موثر تشخیص نمی دهند.
اگر این اتفاق برای شما افتاد، ابتدا مطمئن شوید که نمونه DNA شما تمیز است و حاوی آلاینده نیست. اگر پرایمرهای شما هنوز به طور موثر تقویت نمی شوند، یک جفت پرایمر جدید طراحی و سفارش دهید.
در گذشته سعی کردم پرایمرهای ناکارآمد را عیب یابی کنم تا پارامترهای مناسب (غلظت پرایمر، دمای بازپخت و ...) را بیابم. به نظر من، به ندرت به نتایج خوبی منجر می شود.
منحنی استاندارد qPCR بد ممکن است بیانگر DNA پایین باشد
منحنی استاندارد ضعیف ممکن است توسط پرایمرهای ناکارآمد ایجاد نشود. اگر هدف شما در نمونه شما ضعیف بیان شود، منحنی استاندارد شما ممکن است نادرست باشد. باید بررسی کنید که آیا این هدف در نوع سلولی که مطالعه می کنید بیان می شود. اگر هدف شما ضعیف بیان شده است، مقدار DNA مورد استفاده برای تقویت را افزایش دهید.
از طرف دیگر، می توانید یک مرحله پیش تقویت را برای افزایش بیان هدف خود انجام دهید، که کیت های تجاری برای آن در دسترس هستند.(1) همچنین می‌توانید به جای نمونه‌های RNA خالص، qPCR خود را روی لیزهای سلولی خام انجام دهید تا از از دست رفتن مواد جلوگیری کنید.(2)
مزایای منحنی استاندارد qPCR
علاوه بر دانستن اینکه پرایمرهای شما کارآمد هستند یا خیر، یک منحنی استاندارد حد تشخیص را به شما می گوید. این می تواند به شما در تعیین مقدار مناسب DNA برای استفاده در آزمایشات بعدی کمک کند. چرا از 10 نانوگرم در هر واکنش استفاده می کنیم، در حالی که می توان تقویت خوبی در 1 نانوگرم داشت؟به این ترتیب می توانید از نمونه های گرانبهای DNA خود برای واکنش های qPCR بیشتر صرفه جویی کنید!
به طور خلاصه، ممکن است وسوسه انگیز باشد که از مرحله منحنی استاندارد qPCR صرف نظر کنید، اما امیدوارم شما را متقاعد کرده باشم که چقدر مهم است که برای ارزیابی کارایی پرایمرهای جدید خود وقت بگذارید. صرف زمان در شروع برای اطمینان از کارآمد بودن پرایمرهای شما می تواند در دراز مدت زمان زیادی را صرفه جویی کند و در نهایت به نتایج بهتری منجر شود!
برای بررسی برخی ملاحظات برای تعیین کارایی qPCR، مقاله مرتبط ما را بررسی کنید.
در ابتدا در نوامبر 2016 منتشر شد. ژوئن 2022 بازبینی و به روز شد.
